DAP-seq助力揭示多年生黑麥草LpMYBR1調控葉色的分子機制

文獻題目：LpMPK6 regulates leaf color in perennial ryegrass by inhibiting LpMYBR1-modulated transcription of LpNRT1.5

發表期刊：Journal of Integrative Plant Biology

影響因子：9.3

發表時間：2026年3月12日

發表單位：西北農林科技大學

藍景科信提供：DAP-seq技術服務

主要研究內容

草坪草葉色是評判其觀賞價值與生長健康狀態的核心指標，氮素是構成葉綠素的關鍵元素，硝態氮的吸收、轉運過程顯著影響草坪草葉色表型，而多年生黑麥草中氮素介導葉色調控的分子機制一直未被闡明。本研究發現，低氮/缺營養條件下，LpMPK6過表達株系葉片黃化加劇，葉綠素、總氮及硝態氮含量降低，RNAi株系則保持綠葉、氮素與葉綠素含量更高，證明LpMPK6負調控黑麥草葉色與氮積累。經酵母雙雜交、Pull-down、Co-IP、熒光素酶互補等實驗證實，LpMPK6與轉錄因子LpMYBR1特異性互作，且二者功能拮抗，LpMYBR1能夠改善植株在低氮環境下的葉片持綠特性。

為挖掘LpMYBR1的下游靶基因，本研究借助DAP-seq技術開展全基因組篩選，共鑒定出90001個LpMYBR1結合峰，其中8.2%位于基因啟動子區域；同時預測得到6個MYB轉錄因子保守結合基序。對啟動子區對應的靶基因進行GO功能富集分析，顯著富集到6個氮素調控相關通路，并篩選出LpNRT1.5、LpNRT1.8等硝態氮轉運蛋白候選基因。酵母單雜交、凝膠遷移及雙熒光素酶實驗證實，LpMYBR1能夠直接結合LpNRT1.5啟動子并激活其轉錄，但對LpNRT1.8無調控作用。功能驗證表明，定位于細胞膜的LpNRT1.5特異性介導硝態氮從根系向地上部轉運，并不參與根系對硝態氮的吸收。磷酸化實驗進一步證明，LpMPK6可靶向磷酸化LpMYBR1的第18位T殘基，顯著削弱LpMYBR1的轉錄激活活性；該調控效應會抑制LpNRT1.5表達，降低硝態氮根冠轉運，最終導致葉片氮素與葉綠素合成受阻，引發葉片黃化。

該研究解析了多年生黑麥草中LpMPK6-LpMYBR1-LpNRT1.5的調控通路，優化了葉色與氮素代謝的分子機理研究，對培育低氮適應性強、觀賞品質優良的草坪草品種具有重要指導意義。

圖1. LpMPK6與LpMYBR1的相互作用。（A）酵母雙雜交（Y2H）實驗顯示LpMPK6與LpMYBR1之間的相互作用。（B）熒光素酶互補成像（LCI）實驗表明LpMPK6與LpMYBR1存在相互作用。（C）下拉實驗顯示GST-LpMPK6與His-LpMYBR1的結合關系。（D）共免疫沉淀（Co-IP）實驗證實植物中LpMYBR1-GFP可與LpMPK6-Flag結合。

圖2. LpMYBR1調控LpNRT1.5的轉錄。（A）通過DAP-seq鑒定出的LpMYBR1結合峰在全基因組范圍內的分布。（B）推定LpMYBR1靶基因的GO富集情況。（C、D）野生型、LpMYBR1過表達株及RNAi處理幼苗中15NO3-的吸收效率（C）和根-莖轉運效率（D）。（E）野生型、LpMYBR1過表達株及RNAi處理幼苗中LpNRT1.5的轉錄水平。（F）LpNRT1.5啟動子片段示意圖。（G）LpMYBR1與截短啟動子（pLpNRT1.5T）結合的酵母單雜交實驗結果。（H）LpMYBR1與F1/F2啟動子片段結合的EMSA實驗結果。（I）雙熒光素酶實驗中使用的效應基因與報告基因構建體示意圖。（J）雙熒光素酶實驗的代表性熒光圖像。（K）LUC/REN熒光素酶活性相對值。