南京信帆生物：免疫組化非特異性染色的識(shí)別和原因分析

一、非特異性染色的識(shí)別
常出現(xiàn)在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處，壞死組織及固定不良的組織中心處。表現(xiàn)為彌漫性，均勻性的背景染色。也可以是隨機(jī)分布的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)、團(tuán)或塊狀。
二、非特異性染色的原因
1. Ig與Fc受體結(jié)合
多見(jiàn)于冰凍切片（特別是淋巴造血組織，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，組織細(xì)胞表面多），主要是和二抗反應(yīng)，因?yàn)橐豢挂话阆♂尪染^大，因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體，所以石蠟切片不多見(jiàn)。
避免方法：
① 用以二抗相同種族的正常血清封閉切片；
② 用不含F(xiàn)c段的抗體，但價(jià)格貴
（V區(qū)，C1區(qū)不含F(xiàn)c段，用Pepsin消化）

2．靜電吸附
抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白，容易和帶正電荷的組織相結(jié)合，如膠原纖維。

避免方法：
① 盡量稀釋一抗
② 降低抗體的電荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；
③ 用去垢劑 如triton-100處理切片。 Tween-20等；

3.二抗與組織中的Ig結(jié)合
如羊抗兔的二抗，二抗可以標(biāo)本中（人）Ig發(fā)生交叉反應(yīng)，科學(xué)上越接近的動(dòng)物，交叉反應(yīng)越
明顯，如人與猴，兔與豚鼠。
避免方法：用與待測(cè)組織相同的5%的正常血清稀釋二抗。如人血清。

4．組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合
如醛類(lèi)固定后未能*的沖洗，殘流醛基可以和Ig結(jié)合。
避免方法：
①*沖洗；
② 0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗；

5．內(nèi)源性過(guò)氧化物酶
紅細(xì)胞，粒細(xì)胞的含量尤其高，鏡下可以識(shí)別，不要將其當(dāng)成陽(yáng)性結(jié)果。
避免方法：
① 石蠟切片 0.3%雙氧水-甲醇溶液處理切片；
② 冰凍切片 3%雙氧水處理切片5分鐘（99：1）因?yàn)槲唇?jīng)固定包埋，大部分酶未被破壞；
③ 對(duì)于骨髓涂片
用非過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體
如堿性磷酸酶（AP）
↓
磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料
↓
快蘭(fast blue)或快紅(fast red)
↓ ↓
蘭色 紅色
用明膠甘油封片，不能用含二甲苯的封片劑，溶于二甲苯。

6. 內(nèi)源性*
以 24mg/ml的卵白素封片15分鐘；
7. 交叉反應(yīng)
PcAb敏感性高，但特異性稍低，容易出現(xiàn)非特異性染色。
避免方法：
①盡可能稀釋抗體；
②盡可能用McAb;

三、 抗體zui大稀釋度的求法
zui大稀釋度的目的：
1.節(jié)約、
2.特異性染色↑、非特異性染色↓（決定其zui大稀釋度）
棋盤(pán)法

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