siPOOLs常見問題解答（FAQ）

1. siPOOLs如何提高基因敲低的特異性和效率？

siPOOL是一款包含30條siRNAs的、高復(fù)雜度的混池，通過降低每條siRNA的實(shí)驗(yàn)相關(guān)性以稀釋其脫靶效應(yīng)。專有的siPOOL設(shè)計(jì)算法，可確保較高的轉(zhuǎn)錄本覆蓋率，且避免旁系同源基因，提高基因敲低的效率和特異性。此外，生產(chǎn)的siPOOL包含了規(guī)定長(zhǎng)度和高純度的siRNA標(biāo)準(zhǔn)品，從而大大降低非特異性影響的風(fēng)險(xiǎn)。

2. siPOOLs與其他市售siRNA池有什么區(qū)別？

其他市售siRNA池要么是3-4個(gè)siRNA的低復(fù)雜度混池，要么是不同siRNA長(zhǎng)度的隨機(jī)混池。相比之下，siPOOLs是一款好用、高復(fù)雜度、確定長(zhǎng)度的siRNA混池。

3. 如果我訂購(gòu)一個(gè)siPOOL，總量有多少？我可以用它做多少個(gè)反應(yīng)？

對(duì)于每個(gè)靶基因，siPOOL的規(guī)格有5、10或20 nmol。當(dāng)siPOOL濃度為1nM時(shí)，5 nmol至少足夠用于6孔板的2250個(gè)孔或者96孔板的45000個(gè)孔（參見siPOOL轉(zhuǎn)染方案）。10個(gè)及以上的siPOOL批量訂單，可以定制1-2 nmol的小規(guī)格。請(qǐng)聯(lián)系我們獲取定制報(bào)價(jià)。

4. 從下單到交貨需要多長(zhǎng)時(shí)間？

我們需要大約3-4周的時(shí)間來(lái)交付新的siPOOL。而對(duì)于已有庫(kù)存的siPOOLs，可在2周內(nèi)交貨。根據(jù)序列的不同，某些siPOOLs可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)合成。我們將會(huì)根據(jù)實(shí)際情況及時(shí)和您溝通是否會(huì)延遲交貨。

5. siPOOL可以針對(duì)的最小序列長(zhǎng)度是多少？

通常，目標(biāo)基因的特異性序列≥300個(gè)堿基就可以設(shè)計(jì)siPOOL。在保持種子序列多樣性的條件下，siRNA之間存在一定程度的序列重疊是沒有問題的。請(qǐng)將您的序列信息發(fā)送給我們，經(jīng)過評(píng)估后我們會(huì)告知您設(shè)計(jì)的可行性及建議。

6. 購(gòu)買siPOOL有什么保證呢？

針對(duì)所有編碼基因的siPOOLs均在包含驗(yàn)證的保證范圍內(nèi)。當(dāng)以高達(dá)10nM濃度使用siPOOL，且在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后做RNA定量檢測(cè)分析，我們保證敲低率≥70%。在表達(dá)給定靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中，陽(yáng)性對(duì)照siRNA應(yīng)獲得最佳的轉(zhuǎn)染條件。如果沒有看到≥70%的敲低率，我們將根據(jù)可用的序列免費(fèi)為客戶重新設(shè)計(jì)、合成、驗(yàn)證和發(fā)貨一個(gè)新的siPOOL。由于敲低效率也會(huì)隨著基因的特性而發(fā)生變化，因此使用新的siPOOL能否提高敲低效率，我們無(wú)法做出保證。

針對(duì)非編碼基因的siPOOL，如果未達(dá)到≥60%的敲低率，則根據(jù)可用的序列進(jìn)行重新合成。不過，驗(yàn)證和運(yùn)輸?shù)馁M(fèi)用需由客戶自己承擔(dān)。

7. 為什么不提供針對(duì)長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）的siPOOL驗(yàn)證？

由于二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)合蛋白或細(xì)胞定位等因素限制了RNAi機(jī)制發(fā)揮作用，因此通過RNAi沉默長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）更具挑戰(zhàn)性。根據(jù)可用的轉(zhuǎn)錄序列，我們將提供一輪siPOOL重新設(shè)計(jì)和合成，以靶向lncRNA的不同區(qū)域。然而，siPOOL的驗(yàn)證工作最好還是由熟悉該lncRNA特性的客戶自己開展。

8. 可以提供免費(fèi)樣品進(jìn)行測(cè)試嗎？

目前，只有0.1 nmol陽(yáng)性對(duì)照（GAPDH / KIF11 / INCENP）和陰性對(duì)照siPOOLs可供免費(fèi)測(cè)試。我們歡迎您對(duì)經(jīng)常評(píng)估的基因提出建議，未來(lái)將有可能會(huì)將其作為陽(yáng)性對(duì)照。

9. 能否以更低的價(jià)格提供較小規(guī)格的siPOOL給到我們進(jìn)行測(cè)試或篩選？

≥ 10個(gè) siPOOLs的批量訂單，可以提供較小的規(guī)格，如1-2 nmol。人激酶siPOOL庫(kù)和siPOOL癌癥工具箱中的預(yù)定義siPOOLs也可用于制定較小的規(guī)格。請(qǐng)聯(lián)系我們獲取報(bào)價(jià)。

10. 對(duì)于核定位的RNA，siPOOLs有效嗎？

已經(jīng)有存在于細(xì)胞核中的RNAi機(jī)制的相關(guān)報(bào)道，一些針對(duì)核定位RNA（例如MALAT1，XIST）的siPOOLs可以達(dá)到70%的敲低效率。然而，細(xì)胞質(zhì)定位的RNA可能會(huì)更有效地被RNAi靶向。

11. siPOOLs可以組合在一起同時(shí)敲低幾個(gè)基因嗎？

是的。siPOOLs在低納摩爾濃度下是有效的。這允許在單個(gè)應(yīng)用中組合多個(gè)siPOOLs，以沉默多個(gè)基因，同時(shí)將副作用的風(fēng)險(xiǎn)大大降低。

在一項(xiàng)研究中，siPOOLs同時(shí)成功地沉默多達(dá)四個(gè)基因的表達(dá) [Welsbie, D. S. et al. Enhanced Functional Genomic Screening Identifies Novel Mediators of Dual Leucine Zipper Kinase-Dependent Injury Signaling in Neurons. Neuron 94(6), 1142–1154.e6 (2017)]。

12. 我應(yīng)該使用什么濃度的siPOOL？

在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（例如HeLa，Hek293，A549，MCF7）中，siPOOL通常在借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的情況下采用1-3 nM的濃度。在難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，可能需要更高的濃度，并且可以采用電穿孔等替代方法。我們建議先設(shè)置不同的濃度梯度，以確定具有穩(wěn)定敲低效率的較低濃度。對(duì)于長(zhǎng)期的基因敲低（>3天），建議使用更高的初始siPOOL濃度。另外，我們也可以為您提供劑量?jī)?yōu)化服務(wù)，我們會(huì)采用7個(gè)濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)。如需了解更多信息，請(qǐng)聯(lián)系我們。

13. siPOOL介導(dǎo)的基因敲低效果能持續(xù)多久？

siPOOL敲低基因的持續(xù)時(shí)間與其他siRNA相似，取決于細(xì)胞系和靶基因。基因敲低效果通常可持續(xù)4-7天。但是，高增殖率的細(xì)胞或高活躍度的基因可能會(huì)維持更短的時(shí)間。通過siPOOLs的再轉(zhuǎn)染或提高siPOOL初始濃度的轉(zhuǎn)染，也許可以延長(zhǎng)基因敲低效果的持續(xù)時(shí)間。

14. siPOOL可以靶向特定的亞型嗎？

已證明，siPOOL能夠以高特異性和高效率成功地靶向選定亞型。然而，成功概率還取決于該亞型專有的序列可用性。如有需要，請(qǐng)將您的轉(zhuǎn)錄本NCBI ID發(fā)送給我們，我們可以為您作出評(píng)估。另外，我們還可為您提供跨亞型或物種選擇性的siPOOL驗(yàn)證服務(wù)。

15. siPOOL的陰性對(duì)照是什么？

我們使用不與人類、小鼠和大鼠基因相互作用的標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照siPOOL（30個(gè)siRNAs）。它已在多個(gè)細(xì)胞系中進(jìn)行了測(cè)試，對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡或細(xì)胞形態(tài)沒有顯著影響。另外，我們也可以根據(jù)需要提供Scrambled陰性對(duì)照siPOOL，對(duì)靶siRNA序列進(jìn)行加擾以避免靶標(biāo)相互作用，同時(shí)保持GC含量的百分比（%）。

16. 您的陽(yáng)性對(duì)照siPOOL是什么，讀數(shù)是多少？

陽(yáng)性對(duì)照siPOOL是預(yù)先經(jīng)過驗(yàn)證的siPOOL，當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)會(huì)產(chǎn)生確定的表征，表明轉(zhuǎn)染成功。目前，可用的陽(yáng)性對(duì)照siPOOL所對(duì)應(yīng)的基因，包括：人KIF11（3832），可產(chǎn)生有絲分裂停滯和可觀察到的細(xì)胞死亡現(xiàn)象；人INCENP (3619)，可產(chǎn)生在顯微鏡下可觀察到的細(xì)胞增大表型；人GAPDH（2597），其不產(chǎn)生可觀察到的表型，但通過定量PCR檢測(cè)GAPDH的RNA水平時(shí)，表現(xiàn)為顯著的下調(diào)。也可提供針對(duì)小鼠的GAPDH（14433）和KIF11（16551）的陽(yáng)性對(duì)照siPOOL。

17. siPOOLs可以針對(duì)除人類，小鼠和大鼠以外的其他物種嗎？

是的，siPOOLs可以針對(duì)任何物種。請(qǐng)向我們提供目標(biāo)物種、宿主系統(tǒng)和目標(biāo)序列。

18. siPOOLs的轉(zhuǎn)染條件與其他siRNA有什么不同嗎？

沒有太大的差別。您可以將已經(jīng)優(yōu)化好的siRNA轉(zhuǎn)染條件應(yīng)用于siPOOLs轉(zhuǎn)染中。

19. 有推薦的轉(zhuǎn)染試劑嗎？

市面上的轉(zhuǎn)染試劑種類繁多。對(duì)于許多常見的細(xì)胞系，采用Lipofectamine的轉(zhuǎn)染效果就很好。然而，原代巨噬細(xì)胞或非貼壁細(xì)胞等細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染可能會(huì)存在更多的挑戰(zhàn)。我們可為您提供細(xì)胞系轉(zhuǎn)染優(yōu)化服務(wù)，我們將測(cè)試3種轉(zhuǎn)染方法。如需了解詳情，請(qǐng)聯(lián)系我們。

20. siPOOL的保質(zhì)期是多久？

siPOOLs在-20°C下儲(chǔ)存時(shí)，至少可以穩(wěn)定6個(gè)月。盡管我們觀察到siPOOL在保存幾年后仍存在活性，但是，我們推薦您在收到產(chǎn)品后盡快使用，盡量不超過保質(zhì)期。另外，強(qiáng)烈建議您將較大的體積分裝成小體積再進(jìn)行保存，以避免多次反復(fù)凍融影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

21. siPOOL可以作為一種可發(fā)表的驗(yàn)證方法嗎？

是的。siPOOLs不僅可以用于常規(guī)的基因敲低實(shí)驗(yàn)，而且可以作為其他技術(shù)（如CRISPR，單個(gè)siRNA或shRNA）的補(bǔ)充驗(yàn)證方法。在使用siPOOLs進(jìn)行發(fā)表時(shí)，請(qǐng)引用“siTOOLs Biotech”以及Hannus et al., Nucleic Acids Res, 2014文獻(xiàn)。

22. 是否可以進(jìn)一步的驗(yàn)證siPOOL，例如：開展回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)？

是的。siPOOL敲低效果的進(jìn)一步驗(yàn)證，可以采用抗siPOOL回補(bǔ)序列（siPOOL-resistant rescue constructs）來(lái)開展，它可以表達(dá)siPOOL抗性版本的基因以挽救和恢復(fù)目標(biāo)基因的功能。

23. 是否需要反卷積一個(gè)siPOOL，來(lái)單獨(dú)測(cè)試siRNAs？

我們不建議對(duì)siPOOL進(jìn)行反卷積，因?yàn)檫@會(huì)破壞高復(fù)雜性混池化所賦予的高特異性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證siPOOL結(jié)果，我們建議使用抗siPOOL回補(bǔ)序列。

24. siPOOL以什么形式發(fā)貨？它們?cè)谑覝叵路€(wěn)定嗎？

siPOOL以懸浮液的形式發(fā)貨（10 nM Tris，pH 8.0）。siPOOL經(jīng)測(cè)試可在室溫（RT）下穩(wěn)定至少4周，在37°C下穩(wěn)定1周，在50°C下穩(wěn)定24小時(shí)。因此，溫暖氣候條件下的運(yùn)輸延遲，不太對(duì)siPOOL的活性產(chǎn)生不利的影響。

25. siPOOL文庫(kù)是否可用于功能基因組篩選？

是的。我們有一個(gè)包含505個(gè)siPOOLs的siPOOL人類激酶庫(kù)，可用于高通量功能基因組篩選，以獲得可靠的RNAi效果。另外，用于RNA結(jié)合蛋白、E3連接酶和去泛素酶的siPOOL文庫(kù)，以及其他定制化文庫(kù)，請(qǐng)聯(lián)系我們咨詢。