【CEM】寵物食品中牛磺酸含量的快速制備

一、引言

寵物通常被視為我們直系家庭中毛茸茸的（有鱗、有羽毛等）成員，在現代生活中扮演著重要角色。寵物用品從加熱床到專業美容服務應有盡侑，因此它們的飲食受到更嚴格的審查也就不足為奇了。狗糧形式多樣，不同食譜對健康有益也有風險。近來，無谷物或富含豆類的飲食因其與犬類心臟病——擴張型心肌病（DM）之間的聯系而受到質疑，這種疾病可導致充血性心力衰竭，最終可能導致死亡。DM是由于缺乏牛磺酸引起的，因此狗的飲食必須含有足量的牛磺酸。

在本研究中，使用Discover Prep™系統水解狗糧樣本，以將氨基酸從其結合的蛋白質中釋放出來。與傳統的水解技術相比，Discover Prep利用微波進行樣本水解，將技術的時間框架從24小時縮短至不到一小時。水解后，樣本被中和，并使用Waters AccQ-Tag®試劑盒測量氨基酸含量。結果表明，與傳統方法相比，Discover Prep能夠迅速且準確地從寵物食品中的蛋白質水解出牛磺酸，具有很好的精確度。無谷物狗糧和含谷物狗糧樣本的牛磺酸含量進行了比較。對于實驗室量化狗糧中的牛磺酸和其他氨基酸而言，Discover Prep是一個理想的選擇。

二、材料與方法

試劑和樣品

所有試劑均購自商業供應商。所有狗糧樣品均從當地寵物用品店購買。所有狗糧樣品均使用商用廚房攪拌機研磨。選擇這些狗糧是因為它們的主要蛋白質成分不同，并且標稱含有高含量的牛磺酸。分析了三個樣品：樣品1是三文魚、紅薯和南瓜配方，樣品2是雞肉和紅薯配方，樣品3是火雞和燕麥配方。水解溶液在使用前新鮮制備。

狗糧樣品使用CEM Discover Prep系統進行水解。通過柱前衍生化測定水解產物的氨基酸含量，然后通過UPLC^®注射和在260 nm下的PDA檢測進行分析。使用Waters AccQ-Tag Ultra衍生化試劑盒對水解產物進行LC-PDA分析。Discover Prep樣品制備的結果與傳統烤箱法及營養標簽進行了比較。

Discover Prep樣品制備

將100毫克狗糧樣品加入裝有攪拌棒的35 mL Discover Pyrex^®小瓶中。記錄質量以供分析。對于酸性水解，向每個小瓶中加入5毫升含1%苯酉分的6 N HCl。所有小瓶用N₂吹掃1分鐘，然后迅速蓋上蓋子。樣品按以下Discover Prep方法運行：

酸性水解

小瓶類型：Pyrex

控制類型：動態

溫度：160 °C

時間：30分鐘

壓力：300 PSI

功率：300 W

攪拌：高

傳統水解樣品制備

將40毫克狗糧樣品加入適當的玻璃小瓶中。記錄質量以供分析。對于酸性水解，向每個小瓶中加入2毫升含1%苯酉分的6 N HCl。所有小瓶用N₂吹掃1分鐘，然后迅速蓋上蓋子。然后將小瓶放入設定為110 °C的空氣烘箱中24小時。

水解后樣品制備和衍生化分析

酸性水解樣品用6 N NaOH中和，并用0.26 µm PTFE注射器過濾器過濾。中和后，樣品用Waters AccQ-Tag試劑盒進行衍生化。向一個完整的回收小瓶中加入80 µL來自Waters AccQ-Tag Ultra衍生化試劑盒的硼酸緩沖液。然后，加入10 µL樣品并蓋緊蓋子渦旋。接著，向每個樣品反應中加入10 µL準備好的衍生化試劑。最后，將反應渦旋10秒鐘，然后在55 °C下加熱10分鐘進行分析。

分析

每個衍生化反應取1 μL樣品注入Waters AccQ-Tag Ultra C18柱（1.7 μm, 2.1 x 100 mm），該柱連接到帶有Waters PDA檢測器的Waters ACQUITY™ H-Class UPLC^®。流速設定為0.4 mL/min。柱溫保持在55 °C，吸收波長監測在260 nm。用于分離的洗脫梯度如表1所示。流動相為A: Milli-Q^®水中稀釋10倍的Waters AccQ-Tag洗脫液A和B: Waters AccQ-Tag洗脫液B。為了每種氨基酸創建校準曲線，使用Waters Amino Acid Food and Feed Standard Kit（Waters Corporation, SKU. 186009299）進行衍生化，濃度分別為1, 5, 10, 25, 和50 pmol/μL。采用線性回歸法分析樣品。

表1. 衍生化氨基酸分離所用梯度

三、結果

圖1. Discover Prep水解中回收的牛磺酸量

圖2. 從狗糧中回收的氨基酸量

四、結論

Discover Prep微波反應系統成功水解了寵物食品中的氨基酸，并產生了與傳統烘箱水解相似的結果。在比較氨基酸含量時，傳統烘箱水解和Discover水解的結果%RSD均小于10%。在比較狗糧的牛磺酸含量時，樣品1的含量最高，其次是樣品2和樣品3。